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實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；

5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

腹腔主動脈是人體的大動脈，直接延續于發自左心室的主動脈，胸腔主動脈，沿脊柱左側下行，主要負責腹腔臟器和腹壁的血液供應。動脈發生的一個主要因素是由于血管平滑肌細胞轉變成為了具有繁殖能力的表型。近期的研究表明平滑肌細胞能表達鈣離子通道， ICAM-1和VCAM-1。其中ICAM-1和VCAM-1的表達可能是造成血管壁炎癥反應，并進一步造成血管的原因 。因此，對動脈血管平滑肌細胞的體外培養和研究可用來發現和確定新的血管的靶向方法。

細胞特性：

1）組織來源于實驗動物的正常腹腔主動脈組織。

2)細胞鑒定：平滑肌肌動蛋白（α-SMA）熒光染色為陽性。

3)經鑒定細胞純度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、、酵母和。

5)細胞生長方式：長梭形細胞，不規則細胞，貼壁培養。

推薦培養基：

我們推薦使用 Delf 原代平滑肌 細胞 培養體系 作為體外培養的培養基。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和我們聯系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態、所用培養基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養條件一致，若由于培養條件不一致而導致細胞出現問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現象。觀察好細胞狀態后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養基重懸細胞，并接種到新的培養瓶或培養皿中，置于培養箱中進行培養。

5. 請客戶用相同條件的培養基用于細胞培養。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和我司技術部溝通交流。由于運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩定的情況，請及時和我們聯系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的*培養基來培養細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

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